Les différentes techniques de sélection génétique

par Louis-Marie Houdebine, 3 décembre 2017

Les organismes vivants se caractérisent par leur capacité à se reproduire en puisant dans leur environnement les molécules dont ils ont besoin. Ils peuvent être classés par espèces et sous- espèces. De nouvelles espèces apparaissent tandis que d’autres disparaissent. Ces événements sont lents et ils sont le fruit de sélections diverses.

La sélection naturelle

Les organismes vivants sont tous soumis à des mutations spontanées qui ont lieu au hasard. Les mieux adaptés aux conditions du lieu prospèrent tandis que les autres végètent ou disparaissent

L’invention de l’agriculture et de l’élevage

L’Homme a vécu de chasse et de cueillette pendant des dizaines de milliers d’années puis a inventé l’agriculture et l’élevage il y a environ 10 000 ans. Ces inventions permettent de bénéficier de mieux en mieux des mutations spontanées en favorisant la reproduction des géniteurs les plus productifs et l’établissement de variétés bien définies.

Les mutations aléatoires induites artificiellement

Pour avoir un choix plus large, les semenciers provoquent des mutations non contrôlées par l’action de molécules mutagènes ou de rayons ionisants Les meilleurs géniteurs sont sélectionnés comme dans le cas des mutants spontanés. Il s’agit donc de mutagénèses induites par l’Homme mais basées sur le hasard. La nature de ces mutations au niveau moléculaire commence seulement à être connue. Plusieurs milliers de variétés de plantes ainsi obtenues sont exploitées couramment depuis un demi-siècle pour produire des aliments destinés aux hommes et aux animaux. Les organismes qui résultent de ce type de mutagénèse ne font donc pas intervenir d’ADN étranger. La directive 2001/18 de l’Union européenne définit que les mutants doivent être considérés comme des OGM (organisme génétiquement modifié) si et seulement si leur obtention implique le transfert d’ADN étranger. Les mutants obtenus par l’action de molécules mutagènes ne sont donc pas des OGM au sens strict et pas non plus des OGM cachés.

Le croisement forcé de plantes d’espèces voisines

Pour augmenter la biodiversité plus rapidement, il est possible de croiser artificiellement des plantes d’espèces plus ou moins voisines. La sélection des produits permet d’obtenir des plantes comportant des caractères des deux plantes mères. Le triticale obtenu par croisement de blé et de seigle est une espèce inventée par l’Homme et utilisée comme source d’aliment pour les animaux. Ces opérations consistent à transférer des centaines voire des milliers de gènes inconnus d’une espèce de plantes dans une autre. La sélection permet de retenir les plantes les plus productives et ne présentant pas de propriétés néfastes. Ces plantes hybrides ne sont pas soumises à des réglementations particulières.

Le transfert de gènes conventionnel

Au cours des années 1980, il est devenu possible de transférer spécifiquement des gènes étrangers ayant des propriétés intéressantes dans de multiples organismes vivants. Le cas des variétés de maïs portant un gène de bactérie, un gène Bt, qui s’oppose aux effets néfastes d’une chenille, la pyrale, est représentatif. Ces maïs ont de meilleurs rendements et ils contiennent souvent moins de mycotoxines cancérigènes pour les consommateurs animaux et humains [1] . La technique classiquement utilisée ne permet pas de cibler l’intégration du gène étranger dans le génome de l’hôte mais il est possible d’identifier précisément le site où se trouve le transgène. Il se peut donc que le transgène s’intègre dans un gène de son hôte. Les protéines codées par les transgènes peuvent par ailleurs interférer avec des gènes de son hôte. Les effets de tels événements, qui sont rares, sont étudiés en détail avant que les OGM en question puissent être mis sur le marché.

Le transfert de gènes ciblé

Il peut être souhaitable de procéder à des transferts de gènes ciblés. Une telle opération permet de positionner un gène, quel qu’il soit, dans un génome, de réparer un gène ou de remplacer la version (allèle) d’un gène par une autre version. Il faut pour cela mettre en œuvre un mécanisme de recombinaison homologue.

L’ADN de toutes les cellules est altéré par divers mécanismes. Le plus souvent, un seul des deux brins d’ADN est altéré et il est réparé spontanément en prenant comme matrice le brin non altéré. Le transfert dans une cellule d’un fragment d’ADN dont une partie de la séquence est présente dans le génome de la cellule se traduit avec une très faible fréquence par le remplacement précis de la région ciblée par l’ADN exogène. Le mécanisme mis en jeu repose sur une recombinaison homologue, ainsi nommée car elle fait appel à des fragments d’ADN ayant des séquences très voisines. La coupure des deux brins d’ADN en un site spécifique augmente considérablement la fréquence de la recombinaison homologue. Il existe de nombreuses enzymes capables de procéder à de telles coupures. C’est le cas des enzymes de restriction très utilisées pour les opérations de génie génétique. Ces enzymes reconnaissent chacune essentiellement une seule courte séquence d’ADN présente en nombre variable dans les génomes. Des outils récents, en particulier le système CRISPR-Cas9 [2], permettent de cibler avec précision et efficacité la modification génétique choisie. Ces outils sont en effet capables de couper les deux brins d’ADN en de multiples sites différents. L’enzyme (une endodésoxyribonucléase) qui effectue les coupures, Cas9, est positionnée par un court ARN guide dont la séquence est complémentaire de l’ADN du site ciblé.

Plusieurs situations sont possibles :

1. Le complexe CRISPR-Cas9 est transféré seul dans des cellules.

Une brèche est formée dans l’ADN au site choisi. Le mécanisme de réparation de l’ADN colmate la brèche en apportant pour cela des bases de manière aléatoire. Cette opération est donc souvent une invalidation (ou KO, knock out) ciblée mais non spécifique. Il faut donc sélectionner les variétés ainsi produites pour ne garder que celles qui correspondent à ce qu’attendait l’expérimentateur. Ce protocole est très efficace et il est particulièrement approprié pour déterminer le rôle des gènes dans la mesure où leur absence induit des modifications biologiques des cellules ou des organismes. Cette méthode est particulièrement appropriée pour inactiver des gènes favorisant le développement de maladies ou ayant des effets nocifs divers. Les organismes résultant d’une telle opération ne sont pas des OGM au sens strict puisqu’il n’y a pas d’intervention d’ADN étranger.

2. Le complexe CRISPR-Cas9 est transféré dans des cellules avec des fragments d’ADN complémentaires du site ciblé.

Il est possible d’ajouter au complexe CRISPR-Cas9 des fragments d’ADN exogènes dont la séquence est identique à celle du site génomique ciblé. Un mécanisme de recombinaison homologue permet alors de remplacer le gène ciblé par le fragment d’ADN exogène. Lorsque le fragment d’ADN ajouté comporte des mutations, celles-ci se retrouvent dans l’ADN de l’organisme. Cette opération permet donc de faire une réparation parfaite de la région ciblée qui était altérée. Il peut s’agir alors d’une thérapie génique. C’est ce que l’on cherche à faire par exemple pour remplacer un allèle tumoral par une version saine du gène. On peut de la même manière procéder à des changements d’allèles (les différentes versions des gènes). Les organismes qui résultent de ces opérations ne sont pas des OGM au sens strict, puisque la nouvelle séquence de l’ADN est une des versions que l’on peut trouver dans la nature. Un changement d’allèle a ainsi permis en une seule opération de remplacer un allèle d’un gène de porc européen par un allèle du gène en question provenant de porcs résistant au virus de la peste porcine africaine. Un autre cas dans le règne animal est la suppression par remplacement d’allèle des cornes de vaches [3]. Ces modifications ont lieu en une seule génération sans altérer le génome alors qu’il faut dix à vingt années de sélection classique par la reproduction pour arriver aux mêmes résultats, avec toutefois une évolution non contrôlée du génome. On peut également introduire des gènes exogènes quelconques dans des sites ciblés (knock in). Ces opérations sont apparentées à l’obtention conventionnelle d’OGM, avec toutefois un risque théorique moindre dans la mesure où le transgène est situé dans un site connu et reconnu comme ne posant pas de problème. Ces différents protocoles sont mis en œuvre avec une fréquence croissante et avec des succès répétés chez les plantes par exemple pour combattre les effets nocifs de champignons. Toutes ces opérations pouvaient être effectuées, mais difficilement et à des coûts élevés, avant l’avènement du système CRISPR-Cas9.

Le guidage de gènes

Il est possible de construire des vecteurs contenant les éléments capables d’exprimer la protéine Cas9, un ARN guide et des gènes d’intérêt entourés de deux fragments d’ADN d’un génome. Le transfert du vecteur dans des cellules se traduit par son intégration ciblée dans un des chromosomes suivie par son intégration dans le chromosome homologue. Ce dispositif a pour effet de transmettre le vecteur dans toutes les cellules de la culture aussi bien que dans la totalité des cellules d’une plante ou d’un animal. Il s’agit donc d’un contournement des lois de l’hérédité [2]. Ce protocole est actuellement étudié dans des espaces confinés pour lutter contre des insectes porteurs d’organismes pathogènes. Les vecteurs peuvent à cet effet contenir des gènes induisant la mort des insectes ou des gènes neutralisant leurs effets néfastes. Pour être efficaces, les insectes ainsi génétiquement modifiés doivent être disséminés dans des espaces ouverts. Dans le cas des insectes porteurs d’un gène tueur, leur dissémination se traduit par leur élimination. Le guidage (ou forçage) de gènes peut donc favoriser la dissémination ou l’extinction d’espèces de manière difficilement contrôlable [4].

Le système CRIPR-Cas9 comme outil de ciblage

Il est possible d’inhiber la fonction endonucléase de la protéine Cas9 tout en maintenant sa capacité à se lier à l’ADN génomique à des sites définis par un ARN guide. Il est également possible de lier la protéine Cas9 dépourvue de son activité endonucléase à des protéines comme des méthylases ou des déméthylases connues respectivement pour inhiber ou induire spécifiquement l’expression de gènes en méthylant ou déméthylant localement l’ADN génomique. Les complexes Cas9-protéines apparaissent donc comme des outils permettant l’étude du fonctionnement des génomes mais aussi de contrôler spécifiquement les effets nocifs ou bénéfiques de certains gènes [5].

Tout indique que les produits obtenus par remplacement avec des outils comme CRISPR-Cas9 ne présentent que des risques théoriques extrêmement faibles. Le passage des OGM aux systèmes CRISPR diminue sensiblement les incertitudes inhérentes à toutes les modifications de génomes. Les agences de biosécurité des États-Unis ont commencé à autoriser sans règlement particulier l’utilisation de tels produits. L’Union européenne comme d’habitude tergiverse [6]. Ces problèmes ont fait l’objet d’un colloque organisé par plusieurs académies qui a eu lieu le 21 janvier 2017 : les problèmes éthiques associés à la modification des organismes par la technologie CRISPR-Cas9.

Références

[1] Folcher L et al. (2009). Comparative activity of agrochemical treatments on mycotoxin levels with regard to corn borers and Fusarium mycoflora in maize (Zea mays L.) fields. Crop Protection. Volume 28, Issue 4 : 302-308. https://doi.org/10.1016/j.cropro.20.... Délos Marc. (2013). Base d’information pour une note sur la façon dont les PGM peuvent limiter la présence des mycotoxines dans l’alimentation humaine et animale.
[2] Esvelt KM et al. (2014). Concerning RNA-guided gene drives for the alteration of wild populations. eLife 2014 ; 3 : e03401. DOI : 10.7554/eLife.03401. Voir aussi : Kaplan JC, CRISPR-Cas9 : un scalpel génomique à double tranchant. Science et pseudo-sciences n°320, avril 2017.
[3] Tan W et al. (2013). Efficient non meiotic allele introgression in livestock using custom endonucleases. PNAS. 110 : 16526–16531. doi/10.1073/pnas.1310478110. Voir aussi : Houdebine LM, Les vaches sans cornes. Science et pseudo-sciences n°321, juillet 2017.
[4] Gantz WM et al. (2015). Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi . PNAS. 112 : E6736–E6743, doi : 10.1073/pnas.1521077112
[5] Vojta A et al. (2016). Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation Nucleic Acids Res 44 (12) : 5615-5628. doi : 10.1093/nar/gkw159
[6] Legal limbo (2017). Nature. 542 : 392. http://www.nature.com/polopoly_fs/1...

Mis en ligne le 3 décembre 2017
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